Blog

Sep 29, 2023

Microscopia con illuminazione strutturata a trasmissione con illuminazione a frequenza regolabile utilizzando il gruppo specchio inclinabile

Scientific Reports volume 13, Numero articolo: 1453 (2023) Cita questo articolo 2076 Accessi 4 Dettagli metriche altmetriche Presentiamo la dimostrazione sperimentale della trasmissione assistita dallo specchietto inclinabile

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 1453 (2023) Citare questo articolo

2076 accessi

4 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Presentiamo la dimostrazione sperimentale della microscopia di illuminazione strutturata a trasmissione assistita da specchio inclinabile (tSIM) che offre un ampio campo visivo di imaging a super risoluzione. Un insieme di specchi inclinabili progettati su misura viene utilizzato come modulo di illuminazione in cui il campione viene eccitato con l'interferenza di due raggi riflessi dalla coppia opposta di sfaccettature dello specchio. I modelli strutturati di frequenza sintonizzabile vengono generati modificando l'angolo di inclinazione dello specchio e la disposizione esagonale-simmetrica viene considerata per la risoluzione isotropica in tre orientamenti. L'utilizzo dell'obiettivo ad alta apertura numerica (NA) nella SIM standard fornisce una super risoluzione che compromette il campo visivo (FOV). Utilizzando il rilevamento della lente dell'obiettivo a bassa NA (20X/0,4), dimostriamo sperimentalmente un'immagine con FOV singolo di dimensione \(\sim\) (0,56 mm\(\times\)0,35 mm) con \(\sim\)1,7- e \(\ sim\) Miglioramento della risoluzione di 2,4 volte (sfruttando varie illuminazioni regolando gli specchi inclinabili) oltre il limite di diffrazione. I risultati vengono verificati sia per le sfere fluorescenti che per i campioni biologici. La geometria tSIM disaccoppia l'illuminazione e i percorsi luminosi di raccolta consentendo di conseguenza il libero cambio della lente dell'obiettivo di imaging senza influenzare la frequenza spaziale del modello di illuminazione definito dagli specchi inclinabili. Il FOV ampio e scalabile supportato da tSIM troverà utilizzo per applicazioni in cui è necessaria la scansione di aree di grandi dimensioni come in patologia e applicazioni in cui le immagini devono essere correlate sia nello spazio che nel tempo.

Negli ultimi due decenni, il superamento del limite di diffrazione1,2 della microscopia a fluorescenza classica ha rivoluzionato gli studi biomedici e ha portato a un nuovo campo di ricerca chiamato "nanoscopia ottica"3,4. Nell'area in rapido progresso della nanoscopia, la microscopia a illuminazione strutturata (SIM)5,6,7 appare come una significativa tecnica di super-risoluzione ad ampio campo in cui una serie di modelli strutturati vengono impiegati per eccitare il campione fluorescente e i corrispondenti fotogrammi Moiré grezzi vengono elaborati computazionalmente per ottenere un miglioramento della risoluzione di circa due volte rispetto al limite del campo ampio. Nonostante offra un miglioramento della risoluzione relativamente moderato rispetto ad altre tecniche di super-risoluzione ottica, come la deplezione delle emissioni stimolate (STED),8,9 la microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM),10,11 la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM), 12,13 o deplezione dello stato fondamentale (GSD),14,15 SIM ha attirato notevole attenzione grazie alla sua elevata risoluzione spazio-temporale, bassa fototossicità, compatibilità con la comune etichettatura fluorescente, efficiente imaging multicolore16,17 e così via. È anche considerato un approccio promettente per lo studio della dinamica subcellulare delle cellule viventi18,19 per la sua richiesta di un minor numero di fotogrammi grezzi e di una bassa dose di fotoni. Sebbene il modello di eccitazione strutturato sinusoidale sia la caratteristica chiave per ottenere l'imaging a risoluzione superiore tramite SIM, non è più limitato ai modelli di illuminazione periodici. Anche illuminazioni casuali tipo macchioline20,21 con approcci di ricostruzione cieca sono implementate con successo per l'imaging SIM. Tuttavia, i metodi di illuminazione casuale offrono una super-risoluzione al costo di una bassa risoluzione temporale a causa della necessità di un gran numero di fotogrammi (\(\sim\)100). Questi metodi spazzano via il tema principale dell'imaging con illuminazione strutturata periodica che minimizza il numero di fotogrammi richiesti 9(15) nei casi SIM 2D(3D), ancor meno in alcuni casi22,23 riportati di recente. Pertanto, sono utili gli sforzi per migliorare ulteriormente la risoluzione della SIM mantenendo schemi di illuminazione periodica ben definiti.

Nella tecnica SIM lineare convenzionale, viene utilizzata una singola lente obiettiva per illuminare il campione e per raccogliere il segnale di fluorescenza. Di conseguenza, sia l'illuminazione che l'ottica di rilevamento sono limitate dalla diffrazione dalla stessa lente dell'obiettivo, e il sistema è strettamente limitato ad offrire un miglioramento della risoluzione \(\le\) doppio rispetto al limite di diffrazione classico. Per superare ulteriormente il limite di risoluzione tipico della SIM, è disponibile la fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)-SIM24,25 in cui il modello di interferenza ad alta frequenza delle onde evanescenti illumina il campione. Tuttavia, l'illuminazione TIRF è limitata a una sezione ottica sottile (<100 nm) e quindi si occupa solo dell'imaging 2D. Inoltre, le proprietà di saturazione dei materiali fluorescenti sono sfruttate nell'approccio SIM26,27,28 non lineare che incorpora i contributi di armoniche multiple nell'imaging a super-risoluzione. Tuttavia, il requisito dell'elevata intensità per raggiungere il livello di saturazione operativa dei fluorofori può fornire problemi di fototossicità per l'approccio non lineare. Sono state riportate anche altre tecniche SIM basate su principi diversi, ad esempio plasmoniche29,30, reticoli di proiezione di prossimità31 o chip fotonici32. Ognuna di queste tecniche richiede materiali fotonici o plasmonici sofisticati e dedicati per manipolare il modello di illuminazione strutturata nel piano del campione. Inoltre, sono necessari strumenti appositamente progettati per lo sfasamento e il cambiamento dell'orientamento del modello, ad esempio termoottica per la SIM del chip fotonico o scansione galvonica per la SIM plasmonica. In generale, queste tecniche sono complesse a causa della loro dipendenza dal materiale dedicato; che limita la sintonizzabilità della frequenza del modello di illuminazione. Nella SIM plasmonica, le strutture di array precalibrate sono fabbricate in base all'intervallo di lunghezze d'onda operative. La struttura specifica determina selettivamente l'orientamento e la frequenza del modello di illuminazione, non è possibile accordare il modello. Allo stesso modo, nella SIM del chip fotonico, la frequenza del modello di illuminazione è predeterminata dagli angoli dei bracci della guida d'onda disponibili. Infine, i campioni convenzionali su vetrini da microscopio o vetrini coprioggetto non funzionano con questi metodi. È necessario preparare il campione sulla superficie del materiale progettato che è illuminato dalla figura di interferenza delle onde stazionarie in regime evanescente, limitando queste tecniche alla super-risoluzione 2D-TIRF.