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Jun 28, 2023

Confronto tra tecnologie alternative di purificazione dei vettori virali

Di Jack Vicalvi, ricercatore principale, J2 Biopharm Associates LLC Questa è una panoramica di prodotti e approcci innovativi selezionati sviluppati negli ultimi 15 anni che hanno contribuito a

Di Jack Vicalvi, scienziato principale, J2 Biopharm Associates LLC

Questa è una panoramica di prodotti e approcci innovativi selezionati sviluppati negli ultimi 15 anni che hanno contribuito a miglioramenti consentendo la produzione di terapie per vettori virali con recuperi e purezze più elevati.

Questa è la seconda parte di una serie che esamina alcuni progressi specifici della tecnologia di purificazione. La prima parte ha discusso le apparecchiature e i processi a valle per gli anticorpi monoclonali.

Nella seconda parte, esaminiamo come questi prodotti possono cambiare il modo in cui produciamo tali terapie a base di vettori virali, dove possono essere utilizzati negli attuali schemi di sviluppo dei processi e quali vantaggi conferiscono rispetto ai metodi precedenti. Toccheremo l'economia situazionale che guida l'uso di questi prodotti o approcci innovativi. Infine, ci concentreremo sui modelli di scalabilità GMP per scopi pratici: se non si adatta a GMP, non importa quanto bene funzioni in fase di sviluppo.

Diagrammi di flusso del processo vettoriale virale

La chiarificazione dei raccolti di vettori virali è più complicata della chiarificazione dei mAb. La chiarificazione tradizionale solitamente inizia con la centrifugazione differenziale o in gradiente. Ciò può essere problematico nella migliore delle ipotesi per la produzione GMP su scale superiori a 100 L, poiché le dimensioni del carico batch del cestello della centrifuga sono generalmente piccole (da 10 a 20 L); poi ci sono i problemi relativi alla generazione di aerosol, alla pulizia e alla convalida, nonché i costi delle attrezzature di capitale che potrebbero rappresentare un ostacolo. Anche con una fase di centrifugazione, la filtrazione di profondità e la filtrazione sterile rimangono necessarie. L'uso di filtri di profondità caricati può essere insostenibile a seconda del virus poiché la maggior parte dei virus è legata da porzioni di carica anionica. Tuttavia, in presenza di una concentrazione di NaCl compresa tra 200 e 300 mM, molti virus non verranno rimossi da tali dispositivi, mentre parte del DNA dell'HCP e della cellula ospite è ancora legato.

I virus con involucro come i lentivirus e gli alfavirus sono più labili e potrebbero non adattarsi bene alla filtrazione di profondità. Tuttavia, gli alfavirus sono più robusti e possono essere suscettibili alla filtrazione profonda normale e persino carica. In questi casi, utilizziamo Pall SupraCap 100 (da 4 a 2,1 µm), Pall HCDII (1,2 µm) e AcroPak 500 (da 0,8 a 0,45 µm) in serie. Possono essere utilizzate anche le membrane Millipore DOHC, COHC e XOHC. L'uso di filtri da 0,2 µm solitamente provoca perdite significative e dovrebbe essere evitato fino alla filtrazione finale. Mantenere un sistema chiuso asettico durante la lavorazione è fondamentale.

I virus senza involucro più popolari come gli adenovirus (AV) e i virus adeno-associati (AAV) possono essere chiarificati utilizzando i filtri di profondità caricati 3M in presenza di NaCl da 180 a 250 mM. Utilizziamo i filtri 05SP (da 10 a 2 µm) e 60SP (da 3 a 0,2 µm) in serie per gli alfavirus senza involucro e alcuni alfavirus con involucro.

Il metodo tradizionale per la cattura del vettore virale è AIEX. Ciò può essere ottenuto utilizzando resine o membrane. Per i virus con involucro, l'approccio con membrana è solitamente il migliore poiché è molto più delicato sul virus rispetto al percorso tortuoso attraverso una colonna impaccata. I dispositivi più comuni utilizzati includono Pall Mustang Q, Sartorius Sartobind Q-STIC e il monolite BIA CIMultus. Lo svantaggio maggiore delle membrane o dei monoliti è la loro bassa capacità, che comporta la necessità di utilizzare cicli multipli. Tuttavia, può funzionare anche l'utilizzo di una colonna con un'altezza del letto ridotta (da 6 a 10 cm), con l'ulteriore vantaggio di una capacità notevolmente maggiore rispetto alle membrane. I virus senza involucro comunemente utilizzati possono essere catturati mediante dispositivi a resina o a membrana.

Un metodo alternativo utilizza la cromatografia di affinità. Molti virus hanno siti che legano l’eparina sulle loro superfici, compresi i virus avvolti. Abbiamo avuto successo con l'eparina HyperD come fase di cattura di un alfavirus dopo la digestione e la chiarificazione della nucleasi M-SAN, ottenendo un recupero >90% con un'eccellente rimozione dell'hcDNA e una significativa riduzione dell'HCP durante il funzionamento della colonna a 450 cm/ora. Le resine ceramiche HyperD sono funzionalmente simili alle resine di polistirene. Esistono altri protocolli di purificazione che incorporano Cellufine Sulfate o Capto DeVirS come fase di cattura iniziale; queste resine hanno funzionato bene nella purificazione dei flavivirus.